Molekulargenetische Diagnostik

 

Die molekulargenetische Diagnostik hat zum Ziel, Veränderungen der DNA (des Erbguts) festzustellen bzw. auszuschließen. Insbesondere bei der Aufklärung von Krankheitsursachen gewinnen molekulargenetische Techniken zunehmend an Bedeutung und sind auch für die genetische Beratung bei vielen Fragestellungen unverzichtbar.

 

Hauptanwendungsgebiete sind hier die  Differenzialdiagnostik, die Heterozygotendiagnostik, die Pränataldiagnostik und die prädiktive Diagnostik bei monogen erblichen Krankheiten. Bei jeder pränatalen und prädiktiven genetischen Diagnostik ist laut Gendiagnostikgesetz wegen der potenziell weitreichenden Konsequenzen eines genetischen Befundes eine humangenetische Beratung durchzuführen.

 

MOLEKULARGENETISCHE TECHNIKEN:

Agarosegelelektrophorese
Bei der Gelelektrophorese werden elektrisch geladene Moleküle unter Einfluss eines elektrischen Feldes auf einem Gel aufgetrennt. Die Agarosegelelektrophorese wird zur Trennung von Nukleinsäuren eingesetzt, wie z.B. von PCR-Produkten oder von genomischer DNA vor Anfertigung eines Southern-Blots.

 

Array CGH (Comparative Genomic Hybridisation)
Genomische DNA von Patienten und von gesunden Kontrollen wird mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert und gemeinsam auf einem Array hybridisiert. Durch Messung der Fluoreszenz lassen sich anhand von Intensitätsunterschieden Deletionen oder Duplikationen kleinerer chromosomaler Abschnitte (ca. 20 kb) nachweisen.

 

DNA-Sequenzierung
Für die Suche nach unbekannten Mutationen wird die DNA in der Regel sequenziert.  Nach Anreicherung durch PCR wird die DNA mit DNA-Polymerase und einem Nukleotid-Mix versetzt, welche fluoreszenzmarkierte Stopnukleotide enthält. Bei dieser Reaktion entstehen alle theoretisch möglichen Sequenzfragmente. Nach Auftrennung über eine Kapillarelektrophorese werden unter Einsatz einer speziellen Software die Daten analysiert und daraus die Sequenz bestimmt.

 

FISH-Techniken
Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) bezeichnet ein Verfahren, bei dem fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden direkt auf ein Chromosomenpräparat hybridisiert werden. Zum Einsatz kommen chromosomenspezifische Zentromersonden, Painting-Sonden, welche ganze Chromosomen anfärben und lokusspezifische Sonden.

 

Hybridisierung
Hybridisierung beschreibt einen Vorgang, bei dem sich einzelsträngige Nukleinsäuren mit  zu ihnen komplementären Nukleinsäuresträngen  zusammenlagern.
Durch Hybridisierung mit einer markierten RNA oder DNA-Sonde können auf  einer Membran gebundene DNA-Sequenzbereiche identifiziert werden. Anhand der Lokalisation der Markierung kann z.B. die individuelle DNA-Restriktionsfragmentlänge bestimmt werden.

 

Kapillarelektrophorese
Bei dieser Form der Elektrophorese findet  die Auftrennung in einem dünnen Kapillarrohr in einer Elektrolytlösung statt, so dass sehr kleine Probenvolumina eingesetzt werden können.

 

Methylierungsspezifische  MLPA (MS-MLPA)
Die methylierungsspezifische MLPA (MS-MLPA) stellt eine semiquantitative Methode dar. Die eingesetzen Proben unterscheiden sich von normalen MPLA-Proben dadurch, dass ihre Zielsequenz eine methylierungssensitive Enzymschnittstelle enthält. Das MS-MLPA Protokoll ist dem Standard-MPLA-Protokoll sehr ähnlich, außer dass bei jeder MS-MPLA 2 verschiedene Ansätze generiert werden: ein ungeschnittener Ansatz für die Bestimmung der Kopienzahl und ein geschnittener Ansatz zur Analyse des Methylierungstatus der Sequenz.

 

Methylierungsspezifische PCR
Hier kommen bei der PCR Primerpaare zum Einsatz, die entweder modifizierte DNA oder nicht modifizierte DNA erkennen.

 

MPLA
Die MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) stellt eine Spezialmethode zur Erkennung von Deletionen oder Insertionen (fehlende oder zusätzliche Gensequenzen) dar. Die bei der MPLA eingesetzten Proben sind so gewählt, dass sie bei der Hybridisierung an die zu untersuchenden DNA-Sequenz direkt nebeneinander zu liegen kommen.  Dort werden sie durch eine thermostabile Ligase verknüpft. Das ligierte Sondenpaar wird anschließend in einer PCR amplifiziert. Wenn entsprechende Mutationen vorliegen kann keine Ligation stattfinden, und es entsteht auch kein PCR-Produkt.

 

Oligo-Ligations-Assay (OLA)
Der Oligo-Ligations Assay ist eine schnelle, sensible und spezifische Methode, um bekannte Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP, Single Nucleotide Polymorphism) aufzuspüren.
Sie basiert auf der Ligation zweier sequenzmäßig benachbarten Oligonukleotidproben, nämlich einer sogenannten Capture- oder Fängersonde und einer fluoreszenzmarkierten Reportersonde während des gemeinsamen Annealings an die Target-DNA-Sequenzen.
Typischerweise werden 2 unterschiedliche allelspezifische Capture-Proben eingesetzt, die sich in ihren 3´Enden unterscheiden (Wildtypsonde und Mutationssonde). Im 5´Bereich wurden Wildtyp- und Mutationssonde zudem unterschiedlich lange PEO-Moleküle angehängt.
Eine Ligation der Sonden mit der Reporter Probe kann nun nur stattfinden, wenn kein Fehlpaarung (mismatch) vorliegt., Daher erhält man je nach Genotyp  unterschiedliche Ligationsprodukte. Diese lassen sich anhand der Längenunterschiede und über die Fluoreszenzmarkierung der Reportersonde kapillarelektrophoretisch nachweisen. Oft dient eine Multiplex-PCR als Ausgangsbasis.

 

PCR (Polymerase-Kettenreaktion)
Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode, um die Erbsubstanz DNA in vitro zu vervielfältigen. Nach der Auswahl geeigneter Primer wird mittels einer DNA-Polymerase die zwischen den Primern liegende DNA-Zielsequenz durch wiederholtes Denaturieren, Primeranlagern (Annealing) und anschließende DNA-Synthese (Elongation) vervielfältigt. Der Begriff „Kettenreaktion” beschreibt in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass die Produkte vorheriger Zyklen als Ausgangsstoffe für den nächsten Zyklus dienen und somit eine exponentielle Vervielfältigung ermöglichen. Daher  ist dieses Verfahren sehr sensibel und kann sehr geringe DNA-Mengen nachweisen. Entsprechend penibel muss auf potentielle Kontamination mit  Fremd-DNA geachtet werden.

 

Reverse Hybridisierung
Anders als bei der herkömmlichen Hybridisierung sind hier die sequenzspezifischen Gensonden an eine Membran gebunden. Die zu untersuchende genomische DNA-Sequenz wird in einem vorgelagerten Schritt per PCR amplifiziert, mit Biotin markiert und dann zur Hybridisierung eingesetzt. Nach entsprechenden Waschschritten bleiben nur 100 % komplimentäre Sequenzen an der Membran gebunden. Die resultierende DNA/DNA-Hybride können über den Komplex Biotin/Streptavidin-Alkalische Phosphatase sichtbar gemacht werden.

 

Realtime PCR
Eine Art quantitative PCR, bei der  Detektion von PCR-Produkten über Fluoreszenzsignale stattfindet. Die Zunahme des Signals ist proportional zur Menge des PCR-Produktes und kann online während der Reaktionszyklen mit Hilfe eines Fluoreszenzdetektors verfolgt werden.
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Southern Blot
Beim Southern Blot handelt es sich um eine molekularbiologische Untersuchungsmethode bei der die gesamte genomische DNA zunächst mittels sogenannter Restriktionsendo-nukleasen kleingeschnitten und dann über ein Agarosegel aufgetrennt wird. In einem zweiten Schritt findet nun der Southern Blot statt: dabei wird die DNA aus dem Agarosegel mittels eines Kapillarblotverfahrens auf eine Membran übertragen und an dieser fixiert. Die Membran wird dann in die Hybridisierung eingesetzt.

 

 

 

 

 

 

 

 

 


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